实验一 摇瓶发酵法制备糖化酶
一、实验目的
（1）掌握摇床发酵法制备糖化酶的工艺流程及操作方法
（2）了解利用黑曲霉菌菌种发酵时的生长条件及注意事项
（3）熟练掌握实验过程中的无菌操作和培养条件的选择
二、实验仪器及试剂
菌种：黑曲霉
仪器：锥形瓶（500ml)、移液管、恒温水浴锅、秒表、50mL比色管、牛皮纸、纱布（8层）、pH计。
药品：三水乙酸钠、冰醋酸、硫代硫酸钠、碘、氢氧化钠、硫酸、可溶性淀粉、玉米粉、豆饼粉、麸皮
三、实验原理
摇瓶发酵是实验室常用的通风发酵方法，通过将装有液体发酵培养基的摇瓶放在摇床上振荡培养，以满足微生物生长、繁殖及产生许多代谢产物对氧的需求。它是实验室筛选好气性菌种，以及摸索种子培养工艺与发酵工艺的常用方法。
葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）系统名为淀粉α-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶，俗称糖化酶，是国内产量最大的酶品种。糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原末端切开α-1,4键，也能切开α-1,3键和α-1,6键，产生葡萄糖。
糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶活力。
四、实验步骤
1.培养步骤
1.1种子培养基制备及灭菌
将新鲜土豆去皮切块，称取200~300 g土豆块放入500 mL烧杯中，加入一定量水，在电炉上煮沸至土豆块熟透，用120目纱布过滤，滤渣反复用一定量水清洗、过滤2次，合并各次滤液且定容至1000 mL即得土豆汁。取一定体积的土豆汁，在其中加入5%的蔗糖，溶解摇匀并调pH至5.5，即得种子培养基。将适量种子培养基倒入锥形瓶（250ml），用纱布塞塞住管口，并用牛皮纸包扎，置灭菌锅中，于121℃下灭菌30min。待灭菌完毕，冷却取出。
1.2发酵培养基制备及灭菌
取6只500mL摇瓶，分别按装液量100、200、300mL配制培养基（玉米粉6%、豆饼粉2%、麸皮1%），加水后稍微摇动，使原料湿润，浸入水中。用8层纱布包扎瓶口，再加牛皮纸包扎。置灭菌锅中，于121℃下灭菌30min。
1.3发酵培养基接种：将已生长好的菌种，在无菌条件下，按照10%的接 量（8%-12%）接种到发酵培养基上。
1.4发酵培养基发酵：将摇瓶固定在摇床上，培养温度为31℃，转速为120r/min，培养时间96h。显微镜观察菌丝形态，用试纸测发酵液pH，测定酶活力。摇瓶培养时观察各种摇瓶机的结构。
2.糖化酶活力测定
2.1待测酶液的制备：
精确吸取液体酶1.00mL，先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中。沉渣部分再加入少量缓冲液，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在100~250u/mL范围内），摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。
2.2酶活力测定：
于甲、乙两支50mL比色管中，分别加入可溶性淀粉溶液25mL及缓冲液5mL，摇匀后，于40℃恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）中加入待测酶液2mL，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立刻各加入氢氧化钠溶液0.2mL，摇匀，将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2mL。吸取上述反应液与空白液各5mL，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10mL，再加氢氧化钠溶液15mL，摇匀塞紧，于暗处反应15min。取出，加硫酸溶液2mL，立即用硫代硫酸钠标准液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。
2.3酶活力计算：
样品酶活力（u/g或u/mL）=579.9×(A-B)c×n式中：A与B分别为空白、样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；c为硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；n为稀释倍数。
五、数据分析
比较不同装液量下的菌体形态特征、酶活力，将结果填入下表：
装液量/mL
指标
酶活力
pH
菌体特征 100 420u/mL 4.2 200 510u/mL 4.1 300 570u/mL 3.8 出现球状的白色的菌丝团，瓶壁上出现黑丝的孢子和菌丝
六、 结论
1.不同的装液量对酶活力的影响是随着装液量的增加呈现上升的趋势，但是酶活力变化不大，并且酶活力不高，与其他组数据相比接种量跟酶活力关
2.菌体特征在锥形瓶的瓶壁上出现白色的菌丝，在培养基中也出现了丝球
3.菌种新陈代谢的旺盛二氧化碳的释放增加，使pH值逐渐下降，最终使培养基的pH下降至3.8左右。
实验二 酿酒酵母发酵过程参数的测定及计算
一、实验目的
1.测定并绘制生长曲线、底物消耗曲线和产物形成曲线
2.了解发酵过程中葡萄糖的利用、菌体生长和产物生成的相互关系
3.初步学会菌体生长、底物消耗和产物生成有关发酵参数的求解
二、实验仪器及试剂
菌种：酿酒酵母
仪器：锥形瓶（250ml）、移液管、pH计、生物传感仪、分析天平
药品：酵母膏、胰蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸钠、EDTA钠、氯化钠
三、实验原理
酵母菌是兼性厌氧型真菌，喜欢含糖的环境， 有氧时将葡萄糖分解成CO和水，无氧时将葡萄糖分解成酒精和二氧化碳，同时都释放出能量
生物传感器由生物识别元件和信号转换器组成，能够选择性地对样品中的待测物发出相应，通过生物识别系统和电化学或其他传感器把待测物质的浓度转为电信号，根据电信号的大小定量测出待测物质的浓度。生物传感器是应用生物活性材料（如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等）与物理或化学换能器有机结合的一门交叉学科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法，也是物质在分子水平的快速、微量分析方法
四、 实验步骤
1.种子培养基（YEPD，g/L）：称取酵母膏10g、胰蛋白胨20g、葡萄糖20g，加蒸馏水溶解，调节pH 5.0左右，并定容至1000ml。
2.发酵培养基（g/L）：称取酵母膏10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖100g加蒸馏水溶解，调节pH 至5.0左右，定容至1000ml，分装10个锥形瓶（250ml）封口121℃，30min灭菌。
3.种子培养：将活化好的种子培养液，用移液管移去10ml接种于灭菌YEPD液体培养基中， 于30℃、120 r/min全温摇瓶柜中培养24 h左右，观察种子液的色泽、气味与形态等基本情况。
4.发酵方法：将培养好的种子液按8-12%的接种比例，接种于发酵培养基中，置于30 ℃、120 r/min全温摇瓶柜中培养96 h。
5.过程取样：发酵培养基接种发酵后，每隔8小时取样，移取45ml菌液至离心试管中3800r/min离心，上清液取出分析，菌泥放置烘箱烘干，分析菌体生物量、残余葡萄糖浓度与酒精生成量，并以此为基础数据计算参数
6.生物量的测定：取等量的两份发酵液，一份由烘干法测得菌体干重（DCW），另一份稀释成一定的浓度于630 nm下测定吸光值（OD值），得到标准曲线为DCW=3.87×OD（R=0.996）。再以相同方法测得样品的OD值，按标准曲线计算出菌体干重。
7.还原糖的测定与乙醇的测定：使用生物传感仪测定糖类和酒精的含量
五、 数据分析
创新实验目的：
探究酵母菌在无氧条件下发酵作用产生二氧化碳和酒精。
实验仪器及用品：
1.实验仪器：带胶塞和胶管的锥形瓶、小气球、Y形管、大烧杯、温度计、试管、比色板、小烧杯、玻璃棒。
2.实验用品: 白糖（100g）、一小包干酵母（约30g）、澄清的石灰水、酒精、橙色的重铬酸钾溶液。（检测酒精的试剂。0.5ml的浓硫酸溶有0.1g重铬酸钾，体积分数为95％—97％，在酸性条件下与酒精发生化学反应由橙色变为灰绿色）
实验装置及说明：
澄清的石灰水可以检测气体中有二氧化碳，重铬酸钾溶液遇到酒精由橙色变为灰绿色。 实验操作：
1.将（100ml）40℃温水倒入锥形瓶，再用汤匙将一大勺糖及适量干酵母加进来，搅拌均匀后，将锥形瓶放在大烧杯中水浴保温温度保持在30—40 ℃左右。（先让酵母菌进行有氧呼吸，是酵母菌迅速繁殖，并把葡萄糖分解成二氧化碳和水。）
2. 观察到酵母菌培养液有气泡产生，塞上橡胶塞（这样做既可以避免气体散失，影响后面实验效果，也为酒精的产生提供保障）。过一段时间后就可看到干瘪的气球慢慢膨胀起来了。（酵母菌的无氧呼吸）
3.将夹子打开，挤压气球，使瓶内产生的气体徐徐通过胶管导入试管内的澄清石灰水中，石灰水变浑浊了(检测气体中有二氧化碳。原理：二氧化碳遇石灰水，石灰水变浑浊)。
4.将重铬酸钾试剂分别滴在比色板的凹槽内，并分别标注1号、2号（作对照）、3号。在3号试剂上滴1滴酒精，在1号试剂上滴1滴酵母菌发酵液。发现1号和3号都由橙色变成了灰绿色。
实验创新点及意义：
通过上述实验，让我们对酵母菌“发酵现象”所需要的原料、
条件及产生的物质都有了较直观的感受，比较容易理解课本上阐述的 “酵母菌可以把葡萄糖转化为酒精和二氧化碳”等有关内容，而且印象深刻。使我们养成很好的节约意识。
实验现象：
1. 闻到了发酵后特殊的甜酒的芳香气味。
2. 详见【实验操作4】
3. 澄清的石灰水变浑浊